Alfredo ha chiesto in Matematica e scienzeMedicina · 1 decennio fa

Tecniche di coltura cellulare?

Sono iscritto al primo anno di Tecniche di laboratorio biomedico, devo presentare una tesina riguardante le Tecniche di coltura cellulare, ho girato su internet e siti vari, maggiormente quelli del settore medico, ma non ho trovato nulla di soddisfacente...Qualcuno è esperto della materia o sa dove indirizzarmi???

Grazie!!!

2 risposte

Classificazione
  • Anonimo
    1 decennio fa
    Migliore risposta

    COLTURE CELLULARI (o COLTURE IN VITRO)

    GENERALITA’ E CENNI STORICI

    CARATTERISTICA: Rappresentano uno dei metodi più utilizzati dalla biologia cellulare per l’osservazione di cellule viventi;

    TIPI: colture cellulari; colture tissutali; colture d’organo;

    PRIME COLTURE CELLULARI: Harrison, 1907; Carrel, 1912;

    PRIMA LINEA CELLULARE STABILIZZATA: HeLa (da tumore della cervice) nel 1952

    Tutti i tipi elencati implicano la capacità di sopravvivenza al di fuori dell’organismo tramite l’utilizzo di mezzi adeguati.

    Nei frammenti di organi e tessuti, detti espianti, viene mantenuta l’organizzazione tridimensionale e almeno alcune delle caratteristiche istologiche originali.

    COLTURA ISTOTIPICA: implica che le cellule siano riaggregate a ricreare una struttura simil-tissutale, per es. mediante infiltrazione di una matrice tridimensionale come un gel di collagene.

    COLTURA ORGANO-TIPICA:implica che siano state ricombinate linee cellulari di differente istogenesi.

    TIPI DI COLTURE

    Le colture cellulari possono essere classificate secondo diversi parametri:

    COLTURE A BREVE E LUNGO TERMINE: nel primo caso il n° di cicli cellulari cui vanno incontro le cellule è ridotto, mentre per le colture a lungo termine le cellule si dividono molte volte o addirittura illimitatamente nel caso delle linee cellulari stabilizzate;

    COLTURE IN MONOSTRATO O IN SOSPENSIONE: generalmente le cellule quando crescono tendono ad aderire alla superficie del recipiente di coltura, e questa adesione è richiesta come segnale di sopravvivenza. Moltiplicandosi le cellule formano uno monostrato, in quanto risentono dell’inibizione da contatto. Questo non vale per le cellule trasformate che possono formare anche colture pluristratificate. Le colture in sospensione contengono cellule che possono proliferare senza una superficie di adesione. Questa capacità è un indice di tumorigenicità, e può essere usata in vitro come test per riconoscere sostanze cancerogene.

    COLTURE CLONALI: in questi tipi di coltura le cellule vengono diluite prima della semina in modo tale da avere ogni cellula separata dalle altre, che prolifera formando una colonia singola.

    EVOLUZIONE DI UNA LINEA CELLULARE IN COLTURA

    COLTURA PRIMARIA

    A seguito del prelievo, soltanto le cellule in grado di sopravvivere alla disgregazione e successivamente di aderire al substrato e proliferare daranno origine alla coltura primaria, che è quindi risultato di una prima selezione.

    Nella coltura primaria le cellule discendono direttamente dalle linee del tessuto d’origine, mantenendo quindi molte delle caratteristiche funzionali riscontrabili in vivo.

    Durante la crescita della coltura primaria avviene un’ulteriore selezione in base al grado di proliferazione: in proporzione aumentano le cellule attivamente proliferanti, restano stazionarie quelle in grado di sopravvivere ma non di duplicarsi, mentre altri tipi cellulari sono incapaci di resistere in coltura. Questo comporta un’evoluzione nel tempo delle proporzioni dei diversi tipi cellulari, fino a giungere ad un equilibrio, notevolmente diverso dalla situazione di partenza.

    Quando la proliferazione ha depauperato il mezzo di coltura, è necessario provvedere ad una subcoltura in un nuovo recipiente con terreno fresco.

    LINEE CELLULARI

    Quando si effettua una subcoltura si parla di linee cellulari, che possono essere divise in:

    Linee cellulari a vita finita – hanno un corredo cromosomico diploide, la maggior parte della popolazione cellulare ha lo stesso cariotipo, resiste in coltura un numero limitato di cicli cellulari. Crescono in monostrato risentendo dell’inibizione da contatto, e sono fortemente dipendenti da fattori di crescita presenti nel siero,

    Linee cellulari continue (trasformate) – hanno origine da mutazioni (spontanee o indotte con agenti chimici, fisici o biologici) a partire dalle colture primarie o dalle linee cellulari a vita finita, e naturalmente possono essere ottenute direttamente da tumori. Presentano una minore dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da contatto.

    Linee cellulari clonali – sono linee cellulari derivanti per mitosi da una singola cellula, servono per ottenere una popolazione il più possibile omogenea.

    Durante le subcolture prosegue la selezione, in cui prendono il sopravvento i componenti a maggiore velocità proliferativa. Questo può essere un problema se si è interessati a studiare tipi cellulari meno atti a proliferare in vitro.

    Una curva simile alla precedente descrive il numero di cellule nel tempo in una singola piastra, in cui si possono distinguere una fase di latenza, in cui le cellule si riprendono dallo shock della subcoltura e non proliferano, una fase esponenziale le cellule si moltiplicano alla loro velocità ottimale. Quando sopravviene l’inibizione da contatto – non presente nelle cellule tumorali – si incorre in un plateau, a crescita zero. Si parla di fase stazionaria, che può perdurare qualche giorno, seguita da una fase di decadimento e morte cellulare, prima della quale è necessario procedere ad una subcoltura.

    APPLICAZIONI COLTURE IN VITRO

    Studiare la morfologia cellulare, la divisione cellulare e le interazioni tra cellule;

    Studiare le attività intracellulari;

    Studiare relazioni con ambiente extracellulare;

    Studiare i processi metabolici e l’azione degli ormoni;

    Isolare virus e valutare I loro effetti patogeni;

    Valutazione dell’effetto antiproliferativo o citotossico di agenti antitumorali su linee cellulari stabilizzate di derivazione umana;

    Ricerca sulle cellule staminali.

    TERRENI DI COLTURA

    La sopravvivenza delle colture è legata all’utilizzo di appropriati terreni. Essi inizialmente erano rappresentati da estratti tissutali o fluidi corporei, quali estratti embrionali, siero, linfa, coagulo di sangue, ecc. Attualmente sono disponibili terreni di coltura allestiti sulla base dello studio della biochimica nutrizionale e sulle esigenze delle cellule che vengono poste in coltura.

    È essenziale il controllo della pressione osmotica e del pH.

    I terreni contengono: soluzioni tamponate di amminoacidi, basi puriniche e pirimidiniche, vitamine, zuccheri e sali inorganici.

    I terreni vengono arricchiti con siero bovino, umano o di cavallo o lisati proteici ed estratti embrionali e addizionati di antibiotici per evitare la contaminazione batterica o fungina. Questi liquidi organici contengono fattori di crescita capaci di favorire la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule in coltura.

    Il siero bovino comunemente usato contiene proteine che si depositano fornendo un primo sito di attacco alle cellule.

    SIERO

    L’uso del siero è controverso, e si deve valutare se sia preferibile l’uso di terreni definiti. Generalmente si preferisce il siero di feto in quanto contiene meno anticorpi. Viene scomplementato a 56°C.

    Vantaggi: Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità;· Introduce fattori di crescita ed ormoni;· Veicola lipidi, ferro e molecole organiche;· Favorisce interazione fra cellule e substrato;· Contiene inibitori della tripsina;

    Svantaggi·;· Possibile tossicità degli anticorpi;· Variabilità da lotto a lotto;· Inibitori metabolici;· Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari.

    TERRENI DEFINITI

    L’uso di terreni privi di siero nasce al desiderio di avere condizioni controllate, riproducibili e specifiche per il tipo cellulare in esame.

    Devono contenere: un inibitore della tripsina, fattori di adesione, ormoni, fattori di crescita, nutrienti, proteine e poliamine.

    Vantaggi: Maggiore riproducibilità;· Standardizzazione anche fra laboratori diversi;· Può favorire subpopolazioni specifiche (non solo fibroblasti);· Agevola la purificazione di un prodotto;· Cellule più sensibili alle condizioni ambientali;·

    Svantaggi· Crescita più lenta, saturazione più bassa;· Alcuni additivi sono costosi e/o labili;· I terreni sono specifici per un tipo cellulare;

    COLTIVAZIONE

    Si effettua in speciali contenitori rappresentati da fiaschette (bottiglie) o casule (piastre) in plastica sterilizzate con raggi gamma.

    INCUBATORE

    Le fiaschette o piastre contenenti le colture vengono conservate in un armadio termostatato detto incubatore, in cui viene mantenuta la temperatura di 37°C (T° a cui crescono le cellule di mammifero), viene fatta arrivare una miscela di aria e CO2 ed esiste un’opportuna umidificazione.

    Il pH deve essere 7,3. il pH viene monitorato aggiungendo un indicatore al mezzo di coltura, quale il rosso fenolo (giallo a pH acido, rosso-viola a pH basico).

    CAPPE A FLUSSO LAMINARE

    La manipolazione delle colture avviene sotto speciali cappe nelle quali è mantenuta la sterilità, dette cappe a flusso laminare.

    OSSERVAZIONE DELLE COLTURE

    Viene effettuata mediante microscopi a contrasto di fase in cui la fonte luminosa è posizionata in alto, detti invertoscopi.

    TRYPAN BLUE: permette di effettuare un controllo della vitalità cellulare essendo un colorante che penetra solo nelle cellule morte.

    MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

    MICROSCOPIA CONFOCALE

    ALLESTIMENTO DI UNA COLTURA CELLULARE

    Solo gli elementi cellulari che resistono alle manipolazioni subite e si adattano alla condizioni di coltura sopravvivono dando vita a una coltura primaria.

    Monolayer, confluenza, inibizione da contatto.

    Le cellule riseminate in seguito al distacco con la tripsina rappresentano una linea cellulare.

    Le cellule normali possono dividersi per un numero limitato di volte; pertanto le linee cellulari derivate da tessuti normali si arrestano e poi muoiono dopo un certo numero di duplicazioni cellulari. Questo fenomeno prende il nome di senescenza. Fanno eccezione le cellule staminali e le cellule trasformate. Nei fibroblasti umani la senescenza interviene dopo 30-60 duplicazioni.

    Dopo 14 passaggi in coltura si assiste alla cosiddetta trasformazione, che porta alla costituzione di una linea cellulare continua o stabilizzata. Essa è il frutto di modificazioni genetiche conseguenti alla selezione avvenuta rispetto alla popolazione originale.

    PARAMETRI PER LE COLTURE CELLULARI

    TEMPERATURA: Cellule possono sopportare ipotermia ( essere congelate in azoto liquido) ma non ipertermia. È importante ricordare che questo parametro è direttamente collegato con l’umidità relativa. L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la T°, sia ad evaporare l’H2O dall’apposito vassoio, per portare il livello di umidità relativa alla giusta %.

    UMIDITA’ RELATIVA (RH): nella maggior parte degli incubatori è portata ad un livello elevato senza necessariamente essere controllata. L’obiettivo è limitare l’evaporazione dell’ H2O consentita nei terreni di coltura per non provocare un aumento nella pressione osmotica, che sarebbe incompatibile con la vita della cellule. La difficoltà maggiore consiste nel raggiungere un livello molto elevato di RH nella camera (RH >98% negli strumenti migliori) evitando la condensazione sulle pareti o sugli oggetti contenuti nell’incubatore. Le goccioline di condensazione costituiscono un ambiente ideale per la contaminazione e lo sviluppo di organismi dispersi nell’aria che si introducono nella camera durante l’apertura dell’incubatore.

    pH: Il pH è il parametro meglio regolato dell’organismo con un valore mantenuto a 7,2+-0,2%. Il metabolismo attivo delle cellule in coltura produce grandi quantità dim ioni H+ che provocano in poche ore un’eccessiva acidificazione del terreno di coltura se non viene aggiunto un tampone (il più usato carbonato/bicarbonato).

    La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura corrisponde alla pCO2 cellulare all’interno dei tessuti (35-45mmHg, equivalgono al 4,6-5,9% di CO2). Così l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule

    La CO2 è un parametro importante nella colture delle cellule: una variaziane di pCO2 di +-1% induce una variazione del metabolismo cellulare da -45% a +23%.

    VANTAGGI COLTURE CELLULARI

    Possibilità di coltivare le cellule nelle condizioni scelte dall’operatore e di poterne ottenere i quantitativi desiderati utili all’esecuzione degli esperimenti in particolare per quel che concerne le linee neoplastiche;

    Sistemi semplificati ed altamente riproducibili

    Controllo ambientale

    Economicità e rapidità di risposta

    PROTOCOLLO PER CAMBIO MEDIUM

    Aspirare terreno dalla piastra

    Mettere 10ml di terreno nuovo nella piastra

    Riporre la piastra nell’incubatore

    PROTOCOLLO PER PASSARE LE CELLULE

    Per staccare cellule dalla piastra: aspiri il terreno con aspiratore, le cellule restano così a secco. (Il terreno che si leva nel caso delle PC-3 viene recuperato in una falcon, mentre nel caso delle LNCaP viene buttato).

    Metti nella piastra 3 ml di Tripsina 1% diluita in PBS (che deve essere a 37°C) e poi la riaspiro subito e la recupero nella falcon (che nel caso delle PC-3 contiene il terreno recuperato, mentre nel caso delle LNCaP contiene 10ml di terreno nuovo). Questo passaggio rappresenta una sorta di lavaggio per eliminare residui di terreno. Nella falcon il terreno neutralizza l’azione della tripsina!

    Si mettono 5 ml di tripsina nella piastra che viene messa ad incubare a 37°C per

    3-4’. (Il tempo varia seconda del tipo cellulare.)

    Prendo piastra e con pipettatore aspiro cellule, dopo aver spipettato 2-3 volte per recuperarle tutte, e le metto nella falcon con il terreno.

    Centrifugare a 1500 rpm per 5’ (PC-3) o 1200rpm per 7-8’ (LNCaP). Il supernatante viene aspirato e buttato. Il pellet rappresenta le cellule, dopo averle staccate un po’ dal fondo aggiungo 10 ml di terreno.Spipettare e contare. piastrare

    CALCOLI PER LA CONTA (del n° totale di cellule nella piastra)

    X * 10alla 4 * f * V= N X=N° cellule da contare: cellule che conti osservandole nella camera di Thoma.

    10 alla 4=Fattore di conversione: cellule per ml, perché volume della camera di Thoma è 0,1µl.

    f=Fattore di diluizione che scelgo io.

    V=ml di terreno che ho nella piastra sotto cappa mentre conto

    QUESTI SONO APPUNTI A SCOPO DIDATTICO OTTENUTI

    DA ESPERIENZE DI LABORATORIO LI DEVI RIARRANGIARE VENGONO DA UNA PRESENTARIONE PER UNA LEZIONE RIGUARDO A CELLULE TUMORALI P3 LNCAP ECC. IN BOCCA AL LUPO :-))

  • Anonimo
    1 decennio fa

    Hai trovato me....basta che tu non sia iscritto all'Università degli Studi di Torino, dato che insegno nel tuo corso di laurea...ci sarebbe un palese conflitto d'interessi. Mandami una mail.

    Dr. M. Zolghetti

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