Il sequenziamento si fa su un prodotto di PCR o su DNA isolato e perchè?

E PERCHE'??

1 risposta

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  • 7 anni fa
    Risposta preferita

    Quasi tutte le operazioni di biologia molecolare son condotte su DNA amplificato con PCR. I motivi sono molteplici. In primo luogo, per riuscire nella PCR, si presuppone che tu conosca una piccolissima sequenza della regione di tuo interesse; inoltre, si presuppone che tu abbia rimosso tutte le altre componenti cellulari e stia lavorando solo sul DNA.

    In più, con la PCR tu vai a 'restringere' la zona di tuo interesse, ottenendo tanti frammenti di DNAds tutti uguali.. Da cui poter partire per fare tutti i tuoi studi/esperimenti in maniera certa. Poter fare confronti. Poter ripetere l'esperimento per vedere se i risultati erano attendibili.

    Insomma, ti conviene SEMPRE partire da DNA amplificato - e rispetto all'amplificazione in vettori di clonaggio, quella con PCR è più rapida, pratica e "pulita".

    A questo punto, con i tuoi bei frammenti di DNAds, relativi alla regione che ti interessa, puoi occuparti di fare un sequenziamento di quella regione.

    Anche alla luce del fatto che di solito il sequenziamento lo fai su gel di poliacrilammide (e cerchi di discriminare frammenti che differiscono per l'aggiunta di UN SINGOLO nucleotide!) ti conviene lavorare su regioni "ristrette" e non su un cromosoma intero tutto in un colpo, sennò poi diventa difficile godere di una buona risoluzione e non puoi risalire alla sequenza..

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